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Scientific Reports volume 13、記事番号: 3625 (2023) この記事を引用

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バイオチップベースの研究は現在、生体内微小環境と同様の三次元的かつ大規模な基盤へと進化しています。 これらの標本を長期間ライブで高解像度イメージングするには、ラベルフリーでマルチスケールイメージングが可能な非線形顕微鏡の重要性がますます高まっています。 非破壊コントラストイメージングと組み合わせると、大きな標本内の関心領域 (ROI) を効果的に特定し、結果として光損傷を最小限に抑えることができます。 この研究では、ラベルフリー光熱光学コヒーレンス顕微鏡法 (OCM) が、多光子顕微鏡法 (MPM) で調査中の生体サンプル内で目的の ROI を特定するための新しいアプローチとして機能します。 出力を下げたMPMレーザーによるサンプル内の弱い光熱摂動は、高感度の位相微分光熱（PD-PT）OCMを使用してROI内の内因性光熱粒子で検出されました。 PD-PT OCM の光熱応答信号の時間的変化をモニタリングすることにより、MPM レーザーによって集光されたサンプル内に生成されたホットスポットが ROI 上に位置しました。 x-y 軸での自動サンプル移動と組み合わせることで、MPM の焦点面を体積サンプルの目的の部分に効果的にナビゲートして、高解像度のターゲット MPM イメージングを実現できます。 我々は、2つのファントムサンプルと、幅4 mm、長さ4 mm、厚さ1 mmの寸法の顕微鏡スライド上に固定された昆虫である生物学的サンプルを使用して、第二高調波発生顕微鏡における提案された方法の実現可能性を実証しました。

多光子顕微鏡 (MPM) により、さまざまな生物学研究分野での高解像度分析が可能になります。 近年、MPM の使用は生物医学イメージング、特に小動物の生体内および生きた深部ニューロンイメージング 1,2,3,4,5、腫瘍の早期検出とその特性評価 6,7 の分野で注目を集め続けています。 8,9、バイオチップにおける微小環境における血管網とオルガノイドイメージング10,11,12。 他の同様の変更に加えて、適切な蛍光色素13、補償光学14、マルチビームおよび多焦点機構15、16を採用することにより、イメージング深度を増やし、視野（FOV）を拡大し、体積測定スキャン時間を短縮するための多くのアプローチが存在しています。光学セットアップでは、イメージングのニーズやアプリケーション シナリオに応じて採用可能な MPM イメージング システムのバリエーションが提供されています 5、16、17、18、19、20、21。

光損傷と光退色は、多光子イメージングにおいて考慮すべき重要な要素です。 ラベルフリーの多光子イメージングに必要な高いレーザー出力を伴う長時間の照射では、組織損傷の光メカニズムが発生し、蛍光が増強されて細胞死を引き起こします。これは光損傷と広く呼ばれています 22、23、24。 生細胞での光損傷の発生を回避するには、ピーク強度、繰り返し速度、長時間露光（滞留）時間などのイメージングパラメータが光損傷閾値を十分に下回るように注意する必要があります24。 これらのパラメータのほとんどは、ソースおよび検出システムによって制御できます。 複数の研究グループが、光退色と光損傷の影響を抑制するためのさまざまなアプローチを研究し、提案しました。 最も単純で最も広く採用されている方法は、光源の総照明パワーを減らすことです4、25、26。 ただし、これにより、信号対雑音比が低下するため、システム全体の感度が低下します。 この影響を軽減するために報告されている代替アプローチには、サンプルに照射される光を空間的に制御する制御照射法、照射レーザーパルスを等しいエネルギーのサブパルスに再分配するパッシブパルススプリッターの使用、および高速光走査が含まれます。照明と標本からの発光の収集を制御することで光損傷を軽減するメカニズム27、28、29、30。 さらに、ライトシート照明法を使用すると、検出対物レンズの焦点面のみが効果的に照明されます31。 これらの方法は光損傷や光退色効果を軽減するのに役立ちますが、FOV が小さく、体積スキャン時間が長く、大きなサンプルで関心領域 (ROI) を検索する場合は、長期間の高出力照明が必要となるため、光損傷や光退色が発生します。