Scientific Reports volume 13、記事番号: 13779 (2023) この記事を引用
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ここでは、コヒーレントアンチストークスラマン散乱、第二高調波発生、二光子励起蛍光のラベルフリーモダリティを組み合わせた、マルチモーダル非線形イメージング用のコンパクトなマルチコアファイバー光プローブの開発と応用について報告します。 このマルチコア ファイバー設計のプローブは、遠位端に可動部品や電圧がかかる部品を回避するため、競合する実装に比べて臨床要件との互換性の向上が期待できます。 プローブの性能特性は、ヒトおよびブタの生体外のバルク腸組織を使用して臨床関連サンプルへの適用性を評価する前に、薄い凍結切片と人工ターゲットを使用して確立されます。 データの本質的にピクセル化された性質を打ち消すために画像を再構成した後、記録された画像は、標準的な顕微鏡対物レンズを使用したレーザー走査型顕微鏡で得られたマルチモーダル非線形画像と比較して、組織レベルでの高い画質と形態化学的適合性を示します。 さらに、シンプルだが効果的な再構築手順が提示され、満足のいく結果が得られることが実証されています。 最後に、マルチモーダル ファイバー プローブを実際の臨床評価と応用に応用するためのさらなる開発への明確な道筋が概説されています。
形態学的情報と化学的情報の両方を提供する組織のラベルフリーの in vivo イメージングは、多くの想定される医療用途、特に術中の組織の非侵襲的組織病理学的検査にとって非常に重要です。 ここ数年で、マルチモーダルイメージングアプローチで異なる分光技術を組み合わせることが、速度、浸透深さ、分子特異性のすべての要件を満たすのに有益であることが示されてきました1、2、3。 そのようなアプローチの 1 つは、コヒーレントアンチストークスラマン散乱 (CARS) 顕微鏡法です。これは、他の 2 つの非線形効果、二光子励起蛍光 (TPEF) と第二高調波発生 (SHG) を単一のイメージング デバイス内で同時に生成します。 CARS は特定の分子振動のマッピングを可能にし、最も頻繁に選択される振動は主に脂質 (例: ~ 2855 cm-1、νs(CH2)) またはタンパク質 (例: ~ 2930、νs(CH3)) を示します。生体サンプルに豊富に含まれています。 対照的に、TPEF は、細胞代謝にとって重要であるため組織内に遍在する内因性自己蛍光体、特に NAD(P)H に対処するために使用できます。 さらに、SHG は非中心対称材料でのみ発生するプロセスであるため、コラーゲン線維やミオシン フィラメントなどの準結晶性生体材料に非常に特異的です。 したがって、これら 3 つの非線形モダリティを組み合わせることで、ラベルフリーの方法で組織の形態化学に対する貴重な洞察が得られます。
これに関連して、我々は、CARS、SHG、および TPEF を組み合わせたマルチモーダル非線形顕微鏡により、広範な疾患、特に癌の特徴的な構造とそれに伴う分子変化の検出が可能になることを実証しました 4,5。 CARS/SHG/TPEF 画像データの解釈を容易にするために、高度な画像処理アルゴリズムにより特徴的なプロパティを自動的に抽出できます6、7。 さらに、自動評価と並行して、これらのラベルフリーで記録されたマルチモーダル画像にエンコードされた情報は、多変量統計によって計算上のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E)8 画像に変換することもできることを示すことができます。これは、既存の画像の本体を活用するだけでなく、医療専門家の知識とトレーニングだけでなく、移行期の受け入れにも役立つ可能性があります。 このような計算上の H&E 画像を生成したり、さらなる臨床上の意思決定の基礎となる疾患の等級分けや視覚的セグメンテーションなどのマルチモーダル非線形画像データの自動評価を現場で直接、手術中に直接提供したりするには、コンパクトな手持ち式内視鏡デバイスが必要です。が必要です。 手術創における腫瘍辺縁の検出から、症状の調査、中空臓器（炎症性ボウル疾患など9）における疾患の検出、等級分け、モニタリングに至るまでの応用シナリオにより、非線形分光イメージング用の内視鏡装置の開発は大きな関心の対象となっている。長年。 さまざまなアプローチが提案されています。ポイント スキャニング プローブ 10 以外に、最も一般的なものは、スキャニング ファイバー内視鏡 11、12、13、14、15、16、17、18 と、ガルバノ スキャニング ミラーまたは微小電気機械システム (MEMS) スキャナーを使用する 19、20、21 です。 22、23、24。
90%) in the wavelength range of 400–780 nm. The GRIN lense and DOE assembly was manufactured to stricter tolerances, minimizing vignetting and chromatic errors of the pump and Stokes beams. Additionally, the probe head was refined with a new metal housing to protect and enforce the otherwise fragile fiber connection. For the same reason, Medical Device Regulation (MDR) approved endoscope tubes and SMA connectors were applied to the fibers. A home-built LSM has been used for coupling the excitation laser pulses generated by an 80 MHz mode-locked Nd:VAN laser (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) in combination with an optical parametric oscillator (Levante Emerald, A.P.E, Germany) at 816 nm (pump) and 1064 nm (Stokes) into the imaging fiber34. This wavelength pair corresponds to a Raman resonance of 2850 cm−1, matching the symmetrical stretching vibration of CH2 groups particularly abundant in lipids, which results in a CARS signal at 661.8 nm. As excitation wavelength for the SHG modality, we used the 1064 nm beam, while both beams served as the excitation source for the TPEF modality. The proximal end of the imaging fiber is placed in the focal plane of the LSM where it is scanned by two galvo mirrors in a dense raster pattern, while the distal end of the probe is placed at the tissue sample. The full image circle diameter measures ~ 460 µm, however, a reduced scanning field (~ 260 µm) in the central region of the imaging fiber is used to avoid damaged cores in the fiber, which might have been caused during the manufacturing process of the probe head. The power of the laser beams at the sample site was about 50 mW for pump and 25 mW for Stokes in the probe measurement and 70 mW for pump, and 40 mW for Stokes in LSM recordings. The average laser power used for nonlinear endoscopic imaging provided sufficient signal generation from the presented samples without causing visible damage to any of them and aligns with the power scales utilized in comparable nonlinear endoscopic imaging applications18,35 with use of picosecond laser pulses. A useful point of reference in this context is provided by Galli et al.36 who investigated photodamage under similar excitation conditions as a function of recorded frame repetitions. A schematic setup of the LSM coupled to the probe is depicted in Fig. 1a. Figure 1b shows the internal optical design of the probe head. Two notch dichroic beamsplitters (NFD01-532 (Semrock, USA) and F73-067 (Chroma, USA)), and three bandpass filters (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) and FF01-550/88 (Semrock, USA)) were used in addition to a short-pass filter (FESH0700, Thorlabs, USA) to separate sample signals. In the current design iteration, all optics are designed for a measurement through 170 µm of glass. For easier prototyping and more versatility in the testing phase, the current design does not include a fixed glass window and instead relies on a cover glass to be placed on the sample. The probe design is largely agnostic to the specific LSM used and could, for example, be coupled with a compact fiber-based laser system and scan head to be incorporated into a mobile station, as demonstrated recently for a rigid-body nonlinear endoscope35. An overview of key structural and performance characteristics of the probe is given in Table 1./p>
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